Когато един експеримент се провали, сочели ли сте някога скъпи реактиви или сложни инструменти? Но понякога истинският „виновник“ може да се крие тихо в ъгъла - тази на пръв поглед обикновена бутилка с буферен реагент. Въпреки че е незабележим, той е спасителният пояс за поддържане на точността на експеримента. Днес ще разкрием тайната на този „невидим пазач“.
Ⅰ. Буфер: какво е това? Защо е незаменим в лабораторията?
Просто казано, буферът е специална система от разтвори, която може да устои на ефектите от малко количество добавена киселина, основа или разреждане и да поддържа относително стабилна стойност на pH на разтвора. Обикновено се състои от двойка „партньори“ - слаба киселина и нейната спрегната основа (или слаба основа и нейната спрегната киселина), като оцетна киселина/натриев ацетат (HAc/Ac-), натриев дихидроген фосфат/динатриев хидроген фосфат (NaH₂PO₄/Na₂HPO₄) и др., които са често срещани в лабораториите.
Основна способност: Стабилизира рН и се съпротивлява на промените!
Когато малко количество киселинни или алкални вещества бъдат случайно въведени в експеримента, "партньорът" в буфера ще реагира бързо, като ефективен "пазач на водородни йони", абсорбирайки или освобождавайки го, като по този начин избягва драстични колебания в стойността на pH на разтвора. Тази способност е от съществено значение за много биохимични реакции, които разчитат на специфично pH среда.
Ⅱ. Лабораторен етап: незаменим протагонист и поддържаща роля
1. "Система за поддържане на живота" на биохимични експерименти:
Изследване на ензимната активност:Повечето ензими имат оптимална активност само в тесен диапазон на pH. Буферите (като Tris-HCl, PBS) осигуряват стабилна „работна маса“ за ензимни реакции, за да осигурят надеждни резултати.
Пречистване и анализ на протеини:От клетъчен лизис, хроматографско разделяне (йонен обмен, афинитетна хроматография) до електрофореза (като SDS-PAGE), кристализация и съхранение на протеин, всяка стъпка изисква буфер със специфично рН за поддържане на структурата, заряда и разтворимостта на протеина и предотвратяване на денатурация или утаяване.
Манипулиране на нуклеинова киселина:PCR реакцията, ДНК/РНК екстракцията, ензимното смилане, лигирането, хибридизацията и други процеси са изключително чувствителни към pH. Често използвани буфери като TE (Tris-EDTA) могат да стабилизират структурата на нуклеиновите киселини и да ги предпазят от нуклеазна деградация.
2. "Приспивна песен" на клетъчна култура:Самата среда за клетъчна култура (като DMEM, RPMI) е сложна буферна система (често разчитаща на система натриев бикарбонат/въглероден диоксид). Добавянето на допълнителни буфери (като HEPES) може да осигури на клетките по-стабилна pH среда, особено при смяна на течности, наблюдение или когато концентрациите на въглероден диоксид могат да варират, за да се осигури здравословен клетъчен растеж.
3. „Стабилизиращата сила“ на аналитичната химия:
Хроматографско разделяне:При високоефективната течна хроматография (HPLC) и йонната хроматография (IC) pH на подвижната фаза е ключовият контролен параметър за ефекта на разделяне, а буферите (като фосфати и ацетати) осигуряват възпроизводимостта на процеса на разделяне.
Анализ на титруване:Някои реакции на титруване трябва да се извършат при постоянно рН или да посочат крайната точка, когато се достигне специфично рН, а буферът играе стабилизираща роля.
Приготвяне на стандартни разтвори:Стойността на pH на много стандартни разтвори трябва да бъде прецизно контролирана и буферите са основата.
Ⅲ. Избор и използване: много знания
Изберете правилната буферна система:
pKa стойността е ключова:Ефективният обхват на буфериране на буфер обикновено е в обхвата на неговата pKa ± 1 стойност. Не забравяйте да изберете буфер с pKa стойност, близка до работното pH, от което се нуждаете! Например, фосфатът (pKa ~ 7,2) често се използва в неутралния диапазон на pH, а Tris (pKa ~ 8,1) често се използва в алкалния диапазон.
Съвместимост:Помислете дали буферните компоненти пречат на вашата експериментална реакция (напр. фосфатът може да попречи на някои изследвания на фосфорилиране, а боратът може да реагира със захари).
Йонна сила и температура:Йонната сила влияе на ензимната активност, разтворимостта и т.н.; температурните промени могат значително да повлияят на стойността на pKa на буфери като Tris (Tris има голям pKa температурен коефициент от около -0,031/градус).
Ⅳ. Списък на общите буфери
1. PBS буферна серия
PBS буфер 1× (pH7,4), PBS буфер 10× (pH7,4), PBS фосфатен прах (без калциеви и магнезиеви йони): промиване на клетки в експерименти с клетъчна култура (като преди смяна на хранителната среда); разреждане на антитела и измиване на ELISA плаки в имунологични експерименти; поддържане на осмотично налягане и стабилност на рН при експерименти с протеини/нуклеинови киселини и др.
DPBS буфер (без калций и магнезий), DPBS фосфат на прах (без калциеви и магнезиеви йони): поточна цитометрия в клетъчни експерименти, промиване след смилане на клетките (за да се избегне намесата на калций и магнезий в ензимната активност); разреждане на ензими или провеждане на йон{0}}чувствителни експерименти в молекулярната биология (като определени PCR реакции) и др.
PBST буфер (1 ×), PBST буфер (10 ×): използва се за блокиране и промиване на стъпки в Western Blot или имунохистохимия, намаляване на неспецифичното свързване и др.
2. TBS буферна серия
TBS буфер (1 ×), TBS буфер (10 ×): заменете PBS буфера в имунологични експерименти (за да избегнете фосфатна интерференция с определено свързване на антитела); стабилизиране на алкална pH среда при експерименти с протеини и др.
3. HBSS буферни серии
HBSS буфер (без калций и магнезий, без фенолно червено)/буфер на Ханк (без калций и магнезий): клетъчно разделяне и центробежно промиване в клетъчни експерименти (като поточна цитометрия); краткосрочно - поддържане на клетки (като изобразяване на живи клетки) и др. HBSS буфер (без калций и магнезий, без фенолно червено): поддържа клетъчната метаболитна активност в клетъчната култура (калцият и магнезият участват в сигналната трансдукция); експерименти за клетъчна миграция/инвазия.
4. Серия буфери TE
TE буфер (1 ×), TE буфер (10 ×): разтваряне и съхраняване на ДНК/РНК (Tris поддържа pH, EDTA хелатира металните йони, за да инхибира нуклеазната активност); разредена ДНК за PCR, секвениране и други експерименти.
5. Буферна серия за електрофореза
TAE буфер (1×): конвенционална електрофореза в ДНК агарозен гел (ниска разделителна способност, подходяща за големи ДНК фрагменти). TBE буфер (1×), TBE буфер (10×): ДНК/РНК електрофореза с висока -резолюция (като електрофореза с малки фрагменти или полиакриламиден гел); дългосрочна-електрофореза (капацитетът на буфериране е по-добър от TAE).
6. Буферна серия от експерименти Western Blot
Буфер за прехвърляне на Western Blot (10×): Буфер, използван за прехвърляне на протеини от гел към мембрана (като PVDF мембрана), съдържащ Tris, глицин и метанол.
Tris-HCl буфер (1mol/L, pH6,8): Приготвяне на SDS-PAGE концентриран гел и др.
Tris-HCl буфер (1,5 mol/L, pH8,8): Приготвяне на SDS-PAGE разделителен гел и др.
7. Серия стандартни pH буфери
pH=4.00/6,86/9,18 буфер (приготвен 250mL): стандартен разтвор за калибриране на pH метър (напр. pH6,86 е неутрален стандарт, pH4,00 и 9,18 са киселинни и алкални стандарти).
Буферните реагенти в никакъв случай не са основна помощна роля в лабораторията. Тяхната основна стойност се състои в осигуряването на прецизна и стабилна протонна среда, която е крайъгълният камък за поддържане на термодинамичното равновесие и кинетичната скорост на повечето биохимични реакции. От регулирането на микросредата на ензимните активни места, до гарантирането на конформационна стабилност на биомакромолекулите, до поддържането на трансмембранни йонни градиенти, буферният капацитет на рН на буферната система е незаменима предпоставка за повторяемостта и надеждността на експерименталните данни. Beekman ще ви придружи по време на научното ви пътуване.
Hunan BKMAM Holding Co., Ltd
Уебсайт: www.bkmbio.com
Имейл:info@bkmbio.com